マイクロリットル

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10263 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

医薬品開発を支援し、新しい診断法を作成するために開発されている陽電子放射断層撮影 (PET) トレーサーの数が増加しているため、放射線合成の開発と最適化の必要性が高まっています。 現在の放射線合成装置は、大規模な臨床バッチを生産するように設計されており、多くの場合、放射性核種の崩壊を待って除染する必要がある前に、単一の合成を実行することに限定されており、その後、シンセサイザーのコンポーネントを徹底的に洗浄または廃棄する必要があります。 一部のラジオシンセサイザーでは、1 日に数回の連続したラジオ合成を実行できますが、並列ラジオ合成が可能なものはありません。 1 日に 1 回または数回の実験のスループットは、迅速な最適化実験にはあまり適していません。 これらの制限に対処するために、私たちは液滴放射化学の利点を活用して、放射化学におけるハイスループット実験のための新しいプラットフォームを作成します。 このシステムには 4 つのヒーターのアレイが含まれており、それぞれが小型チップ上の 16 反応セットを加熱するために使用され、多段階放射合成プロセスのあらゆる段階で条件を迅速に最適化するために 64 の並行反応を可能にします。 例として、私たちはいくつかの 18F 標識放射性医薬品 ([18F] フルマゼニル、[18F]PBR06、[18F] ファリープライド、および [18F]FEPPA) の合成を研究し、塩基の種類を含むパラメーターの影響を調査するために 800 以上の実験を実行します。塩基量、前駆体量、溶媒、反応温度、反応時間。 実験はわずか 15 実験日以内に実施され、少量 (従来の機器のスケールが約 1 mL であるのに比べて約 10 μL) により、消費される前駆体はデータポイントあたり約 100 分の 1 でした。 この新しい方法は、放射化学におけるより包括的な最適化研究への道を開き、PET トレーサーの開発スケジュールを大幅に短縮します。

分子イメージングの分野では、生体における生化学プロセスの可視化と定量化を目的として、陽電子放射断層撮影法 (PET) および単光子放射型コンピュータ断層撮影法 (SPECT)1 が開発されました。 短寿命放射性核種でタグ付けされた生物学的に活性な分子を使用すると、このようなイメージングを全身レベルで非侵襲的に実行できるようになります。 PET は、病気の経路の理解 2,3、薬物動態の測定、新しい治療用化合物の生物学的効果の確認 4,5、病気の進行の監視、または治療に対する反応の監視 6,7,8 を支援するために、小動物や人間の幅広い研究に使用されています。 。 PET で使用される一般的な放射性同位体には、C-11 (t1/2 = 20.4 分)、F-18 (t1/2 = 109.8 分)、Ga-68 (t1/2 = 67.7 分) などが含まれます。

放射性医薬品は通常、人への放射線被ばくを制限し、再現性を高めるために自動合成装置を使用して調製されます9。 放射性医薬品のバッチの調製は、放射性合成装置、放射線遮蔽、試薬、放射性同位元素、および熟練した人材のコストが高いため、費用がかかります。 さまざまな条件下で多くの合成を実行する必要がある最適化研究では、これらのコストが大幅に増加します。 さらに、ほとんどの放射性合成装置は、1 日に 1 回または数回の連続した放射性合成のみを目的として設計されているため、最適化の研究には数週間または数か月かかる場合があり、人件費、資源使用量、および放射性同位体コストがさらに増加し​​ます。

最近、放射化学実験のスループットを大幅に向上させる複数のアプローチが報告されています。 張ら。 は、放射能を使用せずに反応を実行しましたが、放射性核種に関連する超低濃度を模倣し、LC-MS/MS 分析の高感度を活用して生成物の収率を評価しました10。 放射能の使用を避けることで実験のスループットは向上しましたが、従来の反応量に依存すると依然として各データポイントを取得するためにかなりの時間と試薬が消費されました。 代替策として、マイクロ流体プラットフォームと小型放射化学技術は、有機化学におけるハイスループット実験の概念を借用することにより、試薬消費を最小限に抑えながらスループットを向上させる有望な手段を提供します11、12、13、14。 いくつかのグループは、フローケミストリーキャピラリーリアクタープラットフォームを使用して、粗生成物をオフラインで収集および分析することで、数十の小規模放射化学反応（つまり、それぞれ10μL、従来のセットアップで使用される約0.5〜2.0 mLと比較して、それぞれ10μL）を連続的に実行できることを示しました18。 、19、20、21。 温度や試薬流量などのパラメータはハイスループットで容易に研究できますが、反応溶媒や[18F]フッ化物の乾燥/活性化の条件などのパラメータは研究できません。 別の最適化プラットフォームでは、ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップを使用して、水性タンパク質放射性標識条件のスクリーニング用に超小規模バッチ (各約 100 nL) を調製しましたが、試薬比と pH 22、23 の変動に限定されていました。

少量のバイアルベースの反応も最適化に使用されており 24、より広範囲のパラメーターを研究できるようになります。 最近、Laube et al. は、マルチバイアル加熱ブロックを使用して 1 日あたり最大約 50 回の放射性フッ素化を実行することを報告しました。各回には、QMA カートリッジから溶出した [18F] フッ化物の少量のアリコートを乾燥させ、その後 25 ～ 50 µL スケールで反応させることが含まれます 25。 この手法では、平行性と試薬消費量の少なさを実証しましたが、バイアル キャップの取り付けと取り外しを含む、バイアルのかなりの手作業が必要でした。 さらに、システムの詳細な加熱特性を考慮することが不可欠であることはよく知られており 26、小さなバイアルで最適化した後、ルーチンの自動生産では条件を従来の合成装置に適合させる必要がある場合があります。

私たちのグループは最近、表面にパターン化された表面張力トラップ内に閉じ込められた液滴内でさらに小さなスケール（つまり 1 ～ 10 μL）で反応が実行されるマイクロ流体プラットフォームを開拓しました 27。 これらの条件下では、液滴反応は通常、従来の方法に匹敵する収率を持ちますが、合成時間が短縮され、反応あたりの試薬消費量が最大 100 分の 1 まで削減できます 28、29、30。 特に注目すべきは、低放射能条件下で最適化した後、開始放射能を単純に増加させるだけで、自動液滴ベースの放射性合成装置を使用して同一条件下で大規模生産（例えば、1 回または数回の臨床用量）を達成できることです。 スループットを向上させるために、最大 16 個の液滴ベースの合成を並行して実行するための複数の反応サイトを備えたチップを作成しました。すべて同じ反応温度と時間で、試薬の量または濃度を変えました 33。 予備研究により、[18F]Fallypride の合成における塩基の量、前駆体濃度、液滴反応体積などのいくつかのパラメーターを最適化できる可能性が示されました。 この論文では、4 つの独立したヒーターのアレイを導入することでスループットと柔軟性がさらに向上し、4 つのチップの並列動作が可能になります。 この改良されたプラットフォームにより、一度に 1 つのチップでは都合よく調査できない追加の反応変数 (反応温度と時間) を並行して調査することができます。

一連の反応は、25.0 × 27.5 mm2 のテフロンコーティングされたシリコン「チップ」上で液滴形式で実行されました (図 1A)。 各反応は、表面張力トラップとして機能する直径 3 mm の円形の親水性サイト (テフロン コーティングをエッチングして除去することによって作成) に限定されました。 チップ製造の詳細は以前に報告されています 33。

ハイスループットの反応装置。 (A) マルチリアクションチップの写真。 (B) プラットフォーム コンポーネントを示す CAD モデル。 (C) 強制空冷の経路を示すマルチ ヒーター プラットフォームの断面図。 (D) マルチリアクション チップが取り付けられたプラットフォーム (上から) の写真。

カスタムビルドの 4 つのヒーター プラットフォームを使用して、複数のチップを並行して動作させました (図 1B ～ D)。 放射線防護を提供するために、プラットフォームはホットセル内で動作しましたが、制御システムは設置面積を最小限に抑えるために外側に配置することもできました。 このプラットフォームは、ケイ酸カルシウム複合材料から CNC 加工された断熱フレームの上にエポキシで接着された 4 つの 25 x 25 mm2 セラミック ヒーターで構成され、そのフレームは 3D プリントされたナイロン片の上に固定され、冷却空気が各ヒーターから直接供給されます。 36 mm 12 V DC ファン 4 個のセット (補足セクション 1)。 熱シミュレーションを実行して、隣接するヒーターからの熱クロストークを回避する適切なヒーター間隔を決定しました (補足セクション 2)。 チップはサーマルペーストの薄い層でヒーターに貼り付けられました。

各ヒーター (およびファン) は独立して制御され、各マルチ反応チップ上の一連の反応を独自の温度または持続時間で実行できるようになりました (補足セクション 1)。 各ヒーターについて、統合された K タイプ熱電対からの信号が増幅され、データ収集モジュール (DAQ) のアナログ入力に接続されました。 ヒーターには、LabView (National Instruments) に実装されたオンオフ コントローラーを使用して、DAQ のデジタル出力によって駆動されるソリッドステート リレーによって切り替えられる 120 VAC で電力が供給されました。 所望の加熱時間の後、DAQ のデジタル出力を使用して強制空冷が作動し、ダーリントン ドライバー回路を介して対応するファンに電力を供給しました。

ヒーターを校正した後(補足セクション3)、統合された熱電対を時間に関して監視することによって温度安定性を評価しました(補足図S6)。 テストした各設定値では、加熱にかかる時間はわずか約 5 秒で、安定すると温度の変動は 1 °C 未満でした (補足表 S1)。 30 °C までの強制空冷には、140 °C から約 3 分、100 °C から約 2.5 分、50 °C から約 1.2 分かかりました。 さらに、各ヒーターの空間温度分布を熱画像により可視化しました。 すべてのヒーターは、端付近（平均から 2% を超える偏差が観察された場合）を除いて、均一な表面温度を示しました（補足図 S7、S8、および表 S2）。 すべての場合において、この使用不可能な領域の範囲は、ヒーターの各端で < 1.5 mm に制限されました。 したがって、マルチ反応チップは 2.4 mm の未使用の境界を使用して設計され、16 個の反応サイトすべてがヒーター表面の均一な部分内に完全に配置されるようになりました (補足図 S9)33。 以前の研究では、チップ上のさまざまな部位での反応の一貫性と、ある部位から別の部位への相互汚染の程度が無視できる程度であることが確認されました33。

このプラットフォームを使用すると、最大 64 の放射化学合成を並行して実行でき、各反応で使用する試薬の量は従来のアプローチよりも約 100 倍少なくなります。 [18F]フッ化物の乾燥を含むすべてのステップがオンチップで実行されるため、合成のどの部分でも使用される条件をハイスループット方式で調査できます。

私たちはこの新しいプラットフォームを使用して、臨床的に関連するいくつかの PET トレーサー、[18F]フルマゼニル [18F]FMZ)、[18F]PBR06、[18F]Fallypride、および [18F]FEPPA の合成に関する広範な研究を実施しました。

[18F]フッ化物の乾燥と放射性フッ素化反応に関連するさまざまな反応条件の影響を比較するために、放射性医薬品ごとに広範な実験が行われました。 私たちの目標は、さまざまな反応パラメーターの影響をより深く理解し、これらのトレーサーの効率的なマイクロスケール合成プロトコルを開発することでした。 初期の液滴反応条件は、基本的に従来のマクロスケール プロトコルから体積を約 100 倍に減らすことによって決定されました。 一般に、実験は 64 の同時反応 (それぞれ 4 チップ × 16 反応) のバッチで実行され、それぞれ n = 4 の反復で 16 の異なる条件を調査しました。

図 2 は、各トレーサーの合成スキームと 16 反応からなる 1 セットの一般化されたプロセスを示しています。 各部位で、[18F]フッ化物ストック溶液（[18F]フッ化物を所望の量および種類の塩基および相間移動触媒と混合したもの）の8μL液滴を反応部位に加え、乾燥させます。 (残留水を除去するための乾燥パラメーターも検討できますが、すべての実験で乾燥は 105 °C で 1 分間実行されました。) 次に、目的の濃度および反応を含む前駆体溶液 8 μL ([18F]Fallypride の場合は 6 μL)乾燥残渣に溶媒を加え、高温で所望の時間反応させる。 反応量もパラメータとして研究できますが、ここでは検討しませんでした。 反応が完了した後、粗生成物を収集する。 チップ上の残留活性を最小限に抑えるために収集パラメーターを最適化することもできますが、すべての場合において、10 μL の収集溶液を反応部位に分注し、その体積を吸引し、これらの手順を 4 回繰り返し、合計 40 μL の収集溶液を得ることで生成物の収集を実行しました。粗製の製品。 反応性能は、ラジオ TLC による [18 F] フッ化物の生成物への変換と、各反応から回収された活性 (出発活性と比較、つまり収集効率) の両方を測定して、全体の粗放射化学収率 (RCY) を測定することによって決定されました。 ）。 TLC 分析は、最近報告されたマルチレーン法を使用し、プレートあたり 8 つのサンプルで実行されました 34。

最適化プロセス。 (A) [18F]フルマゼニルの放射合成スキーム。 (B) [18F]PBR06 の合成。 (C) [18F]Fallyprideの合成。 (D) [18F]FEPPA の合成。 (E) (4 × 4) 多重反応微液滴チップを使用して並列放射合成を実行するための実験手順。 濃度、溶媒、容量はサイトごとに異なり、温度と加熱時間はチップごとに異なります。 (F) 反応性能解析の手順。 収集された粗サンプルの活性は用量キャリブレーターを使用して測定され、開始時の活性と比較されて収集効率が決定されます。 チップ上の残留アクティビティは、Cerenkov イメージングによって分析されます。 粗サンプルはラジオ TLC で分析され、フッ素化効率が測定されます。

[18F]フルマゼニルは、アルツハイマー病、統合失調症、神経可塑性、および感覚プロセスに関連する GABAA 受容体の密度の変化を定量化するために使用されます 35。 我々は、報告されている単離収率が 8 ～ 30% の範囲である市販のニトロマゼニル前駆体からのルート 18,36,37,38,39,40 に焦点を当てました。 他の合成ルートでもより高い収率が得られましたが、ジアリールヨードニウムトシル酸塩前駆体が商業的に入手できないこと41、または同位体交換法のモル活性が非常に低い（0.37 GBq/μmol [0.01 Ci/μmol]）42ため、ここでは追求されませんでした。 。 マクロスケールおよびフローケミストリーのアプローチを使用したこれまでの最適化研究 (表 1) では、通常、研究対象のパラメーターのわずか 2 つの値が比較され、多くの場合、反復があったとしても少数でした 18、36、37、38、39、40。 プラットフォームのスループットの向上を活用して、より細かい粒度 (通常はそれぞれ 8 つの値) とより多くの反復で各パラメーターのより包括的な範囲を調査する一連の実験を実行しました。 調査されたパラメーターには、(i) 反応温度、(ii) 塩基の量、(iii) 前駆体の量、(iv) 反応時間、(v) 反応溶媒、および (vi) 塩基および相間移動触媒の種類が含まれます。 各実験セットの完全な詳細と結果は、補足セクションに記載されています。 2. ほとんどの文献では、溶媒 N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) およびジメチルスルホキシド (DMSO) の使用が報告されているため 18,38、パラメーター i ～ iv に対して実行した研究は、これらの溶媒のそれぞれを使用して実行されました。 各実験の設定例として、図 3 に 4 つのチップを使用して反応温度を調べる方法を示します。 この図には、合成後のチップ上の残留放射能の画像と、変換を評価するために使用された TLC プレートのチェレンコフ画像も示されています。 各条件の結果として得られる性能計算は補足表S3にまとめられており、性能は図4Aにプロットされています。 フッ素化効率は温度とともに大幅に増加しました。 ただし、他の液滴ベースの反応とは異なり、フッ素化反応中の揮発性損失と、収集後にチップに付着した残留活性により、温度の上昇に伴う収集効率の低下につながりました。 (一般に、揮発性損失の量が支配的であり、残留損失よりも約 15 ～ 10 倍高かった。) 得られた粗製 RCY は、200 °C (DMF あり) で最大 13.5 ± 0.6 (n = 4) のピーキング挙動を示しました。 ）。 これらの傾向と一致して、Wong et al. フローリアクターの温度が重要な要素であり、溶媒として DMF を使用するとフッ素化効率が 120 °C で約 0% から 160 °C で約 20% に増加し、DMSO18 を使用すると約 0% から約 5% に増加することを発見しました。 Mandap らは、マイクロ波反応器を使用して、フッ素化効率が温度とともに最大値まで大幅に増加し、その後、高温になると若干低下することも発見しました 38。

[18F]フルマゼニルの合成における反応温度 (8 つの値) と溶媒 (2 種類) の影響を調査する 1 バッチの実験用の実験セットアップ。 (A) 64 の反応部位の割り当て。 32 の同時反応の最初のセットで 4 つの異なる温度を調査するために、反応サイトの半分が最初に使用されました。 次に、サイトの残りの半分を残りの 4 つの温度に使用しました。 (B) チェレンコフ画像は、粗生成物を収集した後の各チップ上の残留活性の分布を示しています。 放射能シグナルは、すべての画像の共通の時点に減衰補正されます。 「X」でマークされた反応は分析されませんでした（誤って前駆体液滴が反応サイトに追加されませんでした）。 (C) 反応溶媒として DMSO を使用した反応で展開された TLC プレート (それぞれ 8 つのサンプルを含む) のチェレンコフ画像。 (D) 反応溶媒として DMF を使用して粗サンプルを分離しました。 破線の円は、分析に使用される ROI を示します。 赤い破線の矢印は、現像中の溶媒の移動方向を示します。 白い点線は、各マルチサンプル プレートの境界を表します。

[18F]フルマゼニルの微小液滴放射合成の性能に対する反応パラメーターの影響。 各パラメーターについて、フッ素化効率、捕集効率、粗製 RCY への影響が個別にプロットされています。 (A) 温度 (および溶媒) の影響。 前駆体の量: 280 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量：480nmol。 反応時間：2分 (B) 塩基 (および溶媒) の量の影響。 前駆体の量: 280 nmol。 反応量: 8 μL。 反応温度：２００℃。 反応時間：2分 (C) 前駆体濃度 (および溶媒) の影響。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応時間：2分反応温度２００℃。 (D) 反応時間 (および溶媒) の影響。 前駆体の量: 280 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応温度：２００℃。 (E) 反応溶媒の影響。 前駆体の量: 280 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応温度：２００℃。 反応時間：0.5分 (F) 塩基の種類 (および溶媒) の影響。 前駆体の量: 280 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応温度：２００℃。 反応時間：0.5分

通常、最適化実験では放射性フッ素化効率 (放射性 HPLC または放射性 TLC によって決定) および/または放射化学収率のみが報告されるため、液滴反応との詳細な比較を行うことが困難であることを指摘しておく必要があります。 放射性フッ素化の効率のみを報告することは、多くの潜在的な損失（例えば、バイアルやチューブに付着した揮発性損失や残留活性など、重大な可能性がある43）が考慮されていないため、誤解を招く可能性があります。 放射化学収率のみを報告すると損失が考慮されますが、（さまざまな合成ステップまたは精製からの）すべての損失はひとまとめにされます。 [18F]フルマゼニルの放射化学的変換収率と放射化学的収率の間には重大な不一致が報告されています 36,37,39。 たとえば、Vaulina et al. フッ素化効率 (TLC) は 25% であることが観察されましたが、HPLC 精製および SPE 製剤化後の単離収率は 2% のみであり、SPE ベースの精製/製剤化後には 9% しか得られませんでした 36。 マサウェら。 フッ素化効率 (TLC) が 27 ～ 35% であるにもかかわらず、単離収率はわずか 2 ～ 5% 40 でしたが、移動相の最適化後は 15 ～ 20% に改善されました 39。 これらの不一致は、精製/製剤化ステップ中の高い損失を反映している可能性があります 36 が、これらの報告書には、他の損失 (例、反応容器またはチューブ上の残留活性、揮発性損失など) を除外するのに十分な詳細やデータが含まれていません。

その後の実験のために温度を 200 °C に固定しました。 塩基量の増加に伴い（図4B）、フッ素化効率がゼロ付近から増加し、塩基量が約150〜200 nmolに達したときに最大値でプラトーになることが観察されました。 収集効率は逆の挙動を示し、DMF (高性能溶媒) の全体的な粗 RCY は急激な増加を示し、塩基が約 160 nmol になるとプラトーに戻りました。 ピペッティングエラーに対する堅牢性を提供する最適量として、240 nmol (粗 RCY がわずかに低い場合) が選択されました。 前駆体量の増加に関する研究 (図 4C) では、フッ素化効率、収集効率、および粗製 RCY が約 80 nmol まで急速に増加し、その後プラトーになることが示されました。 最も高い粗製 RCY (より高性能の溶媒である DMF を使用) は、最適条件として選択された 280 nmol の前駆体量で発生しました。 プラトー以下の前駆体量の強い影響は、160 °C での DMF 中の前駆体 1 mg に対するフッ素化効率が低く (< 3%、n = 1)、高い値 (約 30%) を報告した Mandap らと一致しています。 ) 2 ～ 8 mg の前駆体を含む。 リジコフら。 また、前駆体の量をペアごとに比較した場合、フッ素化効率に顕著な違いがあることも発見しました40。 残念ながら、両方の論文では反応量が範囲として示されているため、濃度値を比較することができません。 多くの反応では、塩基対前駆体の比率が関連パラメーターであるため、補足セクションでこの比率の関数として反応パフォーマンスをプロットしました。 5.4. 約 1 ～ 3 の範囲の比率で粗 RCY が最も高くなり、比率の値が低いと急速に低下し、値が高いと徐々に低下します。 反応時間の増加を調査すると (図 4D)、フッ素化効率は徐々に増加し、収集効率は逆の傾向を示しました (主に揮発性活性の損失による)。 得られた DMF (より性能の良い溶媒) 中の粗 RCY は時間の経過とともに減少し、0.5 分間の反応で最大 15.4 ± 0.9% (n = 4) でした。 反応時間は文献で詳しく研究されていませんが、反応時間を長くすると密閉反応器での合成性能が向上するようです。 リジコフら。 時間を 15 分から 30 分に増やすと、フッ素化効率が 39% (n = 1) から 80% (n = 1) に増加することが観察されました40。

高温および長い反応時間での高い揮発性損失を考慮して、N-メチル-2-ピロリドン (NMP)、1,3-ジメチル-3,4,5 などの追加の高沸点反応溶媒を検討しました (図 4E)。 ,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン (DMPU)、およびエチレングリコールは、他の放射性合成に使用されています 44,45。 NMP を使用すると、DMF と比較してフッ素化効率と粗 RCY が大幅に向上しました。 最終テストとして、反応溶媒 DMF、DMSO、および NMP における塩基および相間移動触媒の種類の影響を比較しました (図 4F)。 最良の組み合わせは NMP と TBAHCO3 でした。 K222/K2CO3 および K222/Cs2CO3 では、はるかに低いパフォーマンスが観察されました。 最適化された条件 (NMP 反応溶媒、240 nmol の塩基 (TBAHCO3)、8 µL 液滴中 280 nmol 前駆体、200 °C、0.5 分間) により、フッ素化効率 37.5 ± 0.8 (n = 4)、収集効率 51 が得られました。 ± 1 (n = 4)、粗 RCY は 19.1 ± 0.6% (n = 4)。 分析用 HPLC による精製 (補足セクション 9.1、または粗 RCY が 18.0% のバッチでは、単離収率 11.6% (n = 1) が得られました。精製をさらに最適化すると、わずかな改善につながる可能性がありますが、調査は行われませんでした。液滴ベースの合成は、他の報告者が報告した単離収量（補足表S11）をわずかに下回る有用な単離収量を達成できると同時に、わずか〜35分以内に完了する（合成とHPLC精製に20分、推定〜配合に必要な時間は 55 ～ 80 分 38,39,40 ではなく 15 分 46)、前駆体消費量が 100 倍削減されます 38,39,40。

ハイスループットアプローチの多用途性を実証するために、次にこのプラットフォームを使用して [18F]PBR06 の放射合成の最適化を実行しました。 このトレーサーは、トランスロケータータンパク質 (TSPO) を標的とすることでミクログリアの活性化を検出し、ハンチントン病の治療反応のモニタリング 47、神経炎症の画像化、および腫瘍進行のモニタリング 48 に使用されます。 放射合成に市販のトシラート前駆体を使用すると、30 ～ 60% の範囲の [18F]PBR06 の単離収率が文献で報告されています 48,49。 しかし、我々の知る限り、異なる反応条件が放射性合成性能に及ぼす影響についての研究は報告されていない。

私たちが調査したすべてのパラメーター (前駆体の量、塩基の量、温度、反応時間、塩基/相間移動触媒の種類) の完全な詳細は、補足セクションに含まれています。 6. [18F]フルマゼニルと同様に、各パラメーターの研究は次の 2 つの異なる反応溶媒で実施されました: DMSO (一般的に文献で報告されています 48、49)、およびテキシルアルコールと MeCN の 1:1 (v/v) 混合物 (他のトシラート前駆体の脂肪族放射性フッ素化に使用されます33)。 前駆体量の研究 (図 5A) では、混合溶媒中での反応は前駆体量の増加に伴ってフッ素化効率が急速に上昇し、前駆体量が約 100 ～ 200 nmol になると約 100% のプラトーに達し、収集効率は一貫して上昇しました。高い。 得られた粗 RCY は、前駆体の量が増加するにつれて急速に増加し、160 nmol の前駆体で 91 ± 4% (n = 4) のプラトーに達しました。 興味深いことに、DMSO 中で行われた反応では、前駆体量が約 100 ～ 200 nmol 未満の前駆体量では傾向が同様でしたが、前駆体量が多くなると、フッ素化効率、収集効率、および粗製 RCY は横ばいになるのではなく、徐々にから中程度の減少を示しました。 それでも、DMSO を使用した場合の最大粗 RCY (86 ± 6%、n = 4) は、混合溶媒を使用して得られたものと同様でした。

[18F]PBR06の微小液滴放射合成の性能に対する反応パラメータの影響。 各パラメーターについて、フッ素化効率、捕集効率、粗製 RCY への影響が個別にプロットされています。 (A) 前駆体濃度 (および溶媒) の影響。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応時間：5分反応温度は100℃。 (B) 塩基 (および溶媒) の量の影響。 前駆体の量: 160 nmol。 反応量: 8 μL。 反応温度：１００℃。 反応時間：5分 (C) 温度 (および溶媒) の影響。 前駆体の量: 160 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応時間：5分 (D) 反応時間 (および溶媒) の影響。 前駆体の量: 160 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応温度：１００℃。 (E) ベースタイプの効果。 前駆体の量: 160 nmol。 反応量: 8 μL。 塩基量: 240 nmol。 反応温度：１００℃。 反応時間：0.5分

塩基量の研究 (図 5B) では、フッ素化効率、収集効率、および粗 RCY は比較的影響を受けず、塩基量が約 150 nmol 未満の場合はわずかな減少のみを示しました。 粗製ＲＣＹは、２４０ｎｍｏｌの塩基で最大であった。 反応温度の研究 (図 5C) では、混合反応溶媒を使用した場合、フッ素化効率は温度に比較的依存しませんでした。 DMSO を使用した場合、フッ素化は 90 ～ 130 °C で最も高くなりました。 収集効率はすべての温度 (および両方の溶媒) にわたって一貫して高く、粗 RCY はフッ素化効率を反映していました。 100 °C の温度が選択されました。 反応時間 (図 5D) はほとんど影響がなく、0.5 分の DMSO を除き、すべての場合で粗 RCY が高く、粗 RCY は大幅に低かった。 最後に、混合溶媒を使用した場合、一般に報告されている相間移動触媒 K222/K2CO3 と比較して、TBAHCO3 を使用した場合に有意な差は見つかりませんでした。 ただし、反応溶媒として DMSO を使用した場合、TBAHCO3 と比較して K222/K2CO3 を使用した場合のフッ素化効率と粗 RCY はわずかに低くなりました (図 5E)。 この比較で使用した反応時間が最適ではなかったため、DMSO の結果は全体的に低くなりました。

全体として、最適条件 (テキシルアルコール 8 µL 中の TBAHCO3 240 nmol、前駆体 160 nmol: MeCN (1:1 v/v)、100 °C、0.5 分) により、フッ素化効率は 97.4 ± 0.2% (n = 4)、粗 RCY は 94 ± 2% (n = 4)。 従来の方法（補足表S18）と比較して、最適条件は大幅に速く（0.5対15分の反応時間）48、より穏やか（100対140℃）48でした。分析規模のラジオHPLCによって精製を実行しました（補足セクション9.2）。 75.8% の単離収率が得られました (n = 1)。全体的な RCY を決定するための配合は行っていませんが、これは文献 48,49 で報告されている全体的な RCY 値 (30 ～ 60%) と比べて遜色なく、10 ～ 30 個消費されました。 × 前駆体が少なく 48,49、文献 49 で報告されている 50 分と比較して、合成プロセスが短縮されました (~ 35 分、つまり合成と HPLC 精製に 20 分、さらに配合に必要な推定~ 15 分 46)。

[18F]Fallypride は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病などのドーパミン作動性系に関連する疾患の研究に使用されます 50,51。 我々は以前に、塩基量、前駆体量、および反応量の影響を調査する、トシラート前駆体からの [18F]Fallypride の液滴合成の予備研究を実施しました 33。 しかし、単一のチップを単一のヒーターで動作させるだけでは、以前は反応温度と時間を簡単に研究できませんでした。 ここで説明するマルチヒーター プラットフォームの拡張機能を使用して、前駆体濃度と組み合わせた温度と反応時間の影響を研究しました。 詳細については補足セクションを参照してください。 7.前駆体濃度の増加に応じて、フッ素化効率と粗RCYはゼロ付近から急速な増加を示し、プラトーに達しますが、収集効率は一貫して高くなります（補足図S41）。 驚くべきことに、95、110、および 125 °C の反応温度でほぼ同一の挙動が観察されました。 しかし、80℃では、最大のフッ素化効率と粗RCYを達成するには、より高い前駆体濃度が必要であることは明らかでした（補足図S41A）。 最大の粗 RCY は 110 °C および 39 mM 前駆体で発生しました。 前駆体濃度と反応時間の複合効果を調べると (補足図 S41B)、反応時間の影響はほとんど無視でき、前駆体濃度が約 20 mM 未満の場合にのみ認識可能な差が生じました。 最高の粗 RCY (93 ± 5%、n = 2) は、6 µL のテキシル アルコール: MeCN (1:1 v /v)。 分析用 HPLC (補足セクション 9.3) による精製後、単離された収率は 74% (n = 1) でした。 このような反応速度論的研究を 1 セットの同時実験で実行できることは、従来の機器やマイクロ流体流動化学システムを使用した典型的な一連の長期にわたる連続研究と比較して、大きな利点です 52,53,54。 このアプローチは、単一の反応を繰り返し冷却したり開いたりして異なる時点でサンプルを抽出する場合よりも、より信頼性の高い反応時間と温度を提供する可能性があります55。

最後の例として、過剰発現を調べるために、近年いくつかの前臨床および臨床現場で使用されている放射性医薬品である [18F]FEPPA の合成の非常に限定的な最適化を実行しました 56,57,58,59,60 TSPO はさまざまな神経変性疾患と関連していることが知られています。 温度の影響を調査するためのハイスループット プラットフォーム (補足セクション 8) を利用して、合成を液滴形式に変換し、少量反応の利点を活用しました。 私たちは、トシレート前駆体を使用した他のトレーサーに関する過去の液滴研究と同様の条件から開始しました。 文献報告には 9 ～ 45 mM の前駆体濃度の範囲が含まれているため 56、57、58、61、初期値 30 mM を選択しました。 温度の上昇の関数として(補足図S44)、フッ素化効率は60℃で約10%であり、90℃以降は急激に増加してプラトーに達しました。 収集効率はすべての温度で一貫して高く、得られた粗 RCY はフッ素化効率と同様の傾向を示しました。 最高の粗 RCY (77 ± 2%、n = 4) は、8 μL のテキシルアルコール: MeCN (1:1 v/v) 溶媒および 240 nmol 中の 30 mM 前駆体、110 °C の温度で 2.0 分間観察されました。塩基(TBAHCO3)の。 文献の方法 (補足表 S22) と比較して、反応時間は短く (2 分対 10 分 56,57,58,61)、液滴反応では消費する前駆体が 40 ～ 50 倍少なく、全体の合成が短くなり、収率が高くなります 56 、57、58、61。 バッチを分析スケール HPLC (補足セクション 9.4) で精製し、収集した画分を 9 mM NaHCO3 で希釈 (1:3、v/v) して、440 MBq [12 mCi] を含む注射に適した等張溶液を生成しました。複数の前臨床研究には十分です。 全体の 30 分間の合成の RCY は 67% (n = 1) でした。

この研究における最適化実験は、約 14 MBq [0.38 mCi] で実行され、各反応では複数のマウス スキャンに十分な生成物が得られることがよくありました 62,63。 それにもかかわらず、我々は、最適化された化合物の 1 つ ([18F]PBR06) を、出発放射能の量以外の反応条件を変更せずに臨床関連レベルまでスケールできるかどうかを検討したいと考えました。 我々は以前、[18F]Fallypride (7.2 GBq を実証)31、O-2-[18F]フルオロエチル-L-チロシン ([18F]FET) および [18F]フロルベタベンについて大幅なスケールアップが可能であることを報告しました。 (それぞれ最大 0.8 GBq を実証)32. 開始放射能を 3.2 GBq (86 mCi) まで増加させる実験については、補足セクションに記載されています。 フッ素化効率の低下により開始活性が増加したため、粗製ＲＣＹはわずかな減少を示したが、精製および製剤化後の最終量は依然として数回の臨床用量に十分である。

これらの結果は、ここで説明したプラットフォームを使用してハイスループット方式で小規模反応を最適化し、開始活動をスケールアップして液滴放射合成の出力を増加できる能力を強化します。 実際、開始活性自体は反応パラメーターとして変更でき、この論文で説明したプラットフォームを使用して高スループットで研究できます。 スケールアップがパフォーマンスにどのような影響を与えるかをより詳細に調査するための研究が現在私たちの研究室で進行中です。

液滴形式で並列放射合成を実行するためにここで紹介したプラットフォームを使用すると、さまざまな反応パラメーターの影響を迅速かつ便利に研究して、合成パフォーマンスに影響を与える条件の詳細なマップを取得することができました。 各放射性医薬品合成は、数バッチの放射性同位体のみを必要とし、数日で広範に調査 (数百のデータポイント) できます。 合計で、4 つの例示化合物について、15 実験日で 820 件の実験が完了し、1 日あたり平均 55 件の反応が行われました。 1 日に完了する実験の最大数は 64 でしたが、おそらくこの数を最大 96 まで増やすことは可能です。制限要因は、試薬の追加、粗生成物の収集、および TLC 分析の実行という面倒な手作業であることです。 ハイスループット実験用の自動化プラットフォームが現在開発されており、これによりこれらの問題に対処でき、おそらく反応スループットをさらに向上させながら、放射線被ばくや人的ミスの可能性も減らすことができます64。 1 日に多くの反応を実行すると、最適化にかかる総時間 (したがって人件費やその他のコスト) が節約され、必要な放射性同位元素のバッチがはるかに少なくなり、放射性同位元素の生産コストや購入コスト、輸送コストが大幅に削減されます。 重要なのは、放射性同位体の品質や試薬の調製などの日々の変動も結果に影響を与える場合があるため65、総実験日数（および放射性同位体バッチ）を減らすことにより、この変動による交絡効果も軽減されます。 さらに、従来のリアクター (0.5 ～ 2.0 mL) と比較して小規模液滴反応 (6 ～ 8 μL) を使用すると、データポイントあたりの試薬使用量が約 10 ～ 100 分の 1 に削減されました。 消費された前駆体の総量は、[18F]フルマゼニルでは 355 データ ポイントでわずか 30 mg、[18F]PBR06 では 296 データ ポイントで 20 mg、[18F]Fallypride では 128 データ ポイントで 6 mg、および 32 データ ポイントで 4 mg でした。 [18F]FEPPAのポイント。 これらの量は、[18F]フルマゼニル (各 5 mg) ではわずか 12 回のマクロスケール反応、[18F]PBR06 (各 3 mg) では 6 ～ 7 回、[18F]Fallypride では 3 回 (各 2 mg)、および [ 18F】フェッパ。 さらに、場合によっては、生成物の活性量は、インビトロまたは前臨床のインビボイメージング研究に十分である場合があります。 これは、前駆体が不足している新しい放射性トレーサー開発にとって大きな利点となる可能性があります。 液滴プラットフォームにより、わずか数 mg の前駆体を使用して、最適化と最初の予備的な生物学的研究の両方を最短時間で実行できるようになります。

従来のラジオシンセサイザーとは別に、連続フローマイクロ流体プラットフォームを使用して、迅速かつ経済的な最適化も実行されています。 少量の試薬 (10 μL) を異なる条件下で連続的に反応させます 20,66 (1 日あたり最大 25 回の実験が報告されています 67)。 滞留時間、反応物質の濃度と比率（相対流量の変化による）、反応温度の影響を研究するのには便利ですが、他の条件（溶媒など）を変化させるのは面倒で、変化ごとに手動介入や洗浄手順が必要です。 さらに、一部の側面 ([18F] フッ化物乾燥条件など) は、フローケミストリーのワークフローの外側で実行されるため、ハイスループットの方法では調査できません。 液滴リアクターは、これらすべての変数を研究するのに適しており、反応を逐次ではなく並行して実行できます。 液滴反応を使用した最適化のさらなる利点は、マルチヒーター プラットフォームがコンパクト (120 × 120 × 100 mm3) であるため、ホットセルまたはミニセルの小さな部分での動作が可能であることです。 軽量 (約 900 g) であるため、システムは持ち運びが容易で、ホットセルへの出入りも簡単で、最適化の取り組みが必要な場合にのみスペースを占有します。 対照的に、従来のラジオシンセサイザーとフローケミストリーシステムは通常、はるかに大きく、インフラストラクチャー（ガス、真空）に統合されているため、簡単に移動できません。

オープンマイクロドロップレットシステムのユニークな特徴は、合成プロセスのさまざまな段階でチェレンコフイメージングを介してチップ表面上の放射能分布を視覚化および定量化できる利便性です。 この情報により、各ステップのパフォーマンスをより包括的に評価できます。 一部のマクロスケールシステムには、反応容器やカートリッジの近くに放射線検出器が組み込まれており、これらのコンポーネントの直接的な放射能測定が可能になり、損失を特定するのに役立ちます43が、他のシステムでは放射能測定を行うためにコンポーネントを取り外し/分解する必要があり、これは実行不可能または不便であり、放射線被ばくが増加する可能性があります。 比較すると、当社のハイスループットアプローチでは、このデータを一度に多くの反応に対して並行して簡単に収集できるため、時間を大幅に節約し、放射線被ばくを減らし、エラーの可能性を減らすことができます。

一方、このアプローチの制限は、オープン液滴形式では一部の合成で揮発性損失が大幅に発生することです。 揮発性損失は、液滴形式の [18F]PBR06、[18F]Fallypride、および [18F]FEPPA (および他の多くのトレーサー 28,46,68) では非常に低かったが、[18F]フルマゼニルでは損失が大きく、次のことが判明した。放射性フッ素化ステップ中に発生します。 対照的に、マクロスケールのシステムでは、通常、反応中は反応器が閉じられており、このステップでの損失は通常より低くなる可能性があります。 もちろん、液滴システムと従来のシステムは両方とも、溶媒蒸発ステップ中など、放射合成プロセスの他の段階で揮発性損失を示す可能性があります。 揮発性の損失にもかかわらず、意味のある再現可能な実験は依然として実行できました。 さらに、[18F]フルマゼニルの単離収率（かなりの揮発性損失があった）は、他の報告者が報告した単離収率（製剤化前）の範囲をわずかに下回っただけであり、揮発性種の損失が全体の反応性能にそれほど悪影響を及ぼさないことを示唆しています。 、あるいはおそらく、反応損失は他の改善によって相殺されたと考えられます（たとえば、おそらく半分取用 HPLC カラムの代わりに分析用カラムを使用したことで、精製損失の程度が減少しました）。 もちろん、揮発性損失は危険をもたらしますが、適切なホットセル内でシステムを動作させることによって軽減する必要があります。

ここでの研究は一度に 1 変数 (OVAT) 法を使用して実行されましたが、実験計画法 (DoE)65 や反応モデリングなどの概念を統合することで、さらなる最適化効率の向上が達成される可能性があります。 ここで最適化された反応に加えて、液滴形式は他の 18F 標識放射性医薬品と互換性があります 28、29、46、69。 放射性金属を含む他の同位体でも使用できる可能性があります。 このプラットフォームは放射化学実験室での操作向けに設計されていますが、放射化学の分野以外の幅広い化学反応の試薬経済の最適化にも使用できる可能性があります。 最近、1.5 ～ 100 µL の量で有機反応のスクリーニングを実行するためのいくつかの新しいプラットフォームと技術が報告されており 15,16、当社のプラットフォームは、さまざまな同時反応に対して反応温度と時間を変更する機能を強化できます。

この研究では、液滴ベースの反応アレイに依存した放射合成最適化プラットフォームを開発しました。これにより、それぞれの試薬消費量を最小限に抑えながら、多くの反応 (最大 64) を並行して実行できるようになります。 ハイスループットの分析手法 34 と組み合わせると、数日で数百件の実験を実行することが現実的になります。 スループットはフロー化学ベースの最適化手法と同様ですが70、このプラットフォームでは、[18F]フッ化物の乾燥/活性化を含む合成プロセスのすべての段階の研究が可能であり、チップが最適化にも適合することが以前の研究で示されています。少なくとも 2 つの合成ステップを含む反応 29,46。 また、フローベースのシステムの制約を受けることなく、反応溶媒と試薬の量を容易に変更することもできます。 最後に、開始アクティビティを変更することにより、最適化後に生成物の量をスケールアップできます。

例として、このプラットフォームを使用して、市販の前駆体からの [18F]Flumazenil、[18F]PBR06、[18F]Fallypride、および [18F]FEPPA の生成の迅速な最適化を実行しました。 このプラットフォームを使用して、6 つの異なる反応パラメーターにわたる、異なる条件 ([18F] フルマゼニルについて 85、[18F]PBR06 について 74、[18F] ファリープライドについて 64、および [18F] FEPPA について 8) を使用した一連の合成を実行しました。 。 各条件について反復研究が実行され、各反復セットで計算された標準偏差が小さいことから、プラットフォームの再現性が高いことが示されました。 [18F]フルマゼニルの場合、観察された傾向は、従来の放射性合成装置を使用して実行された最適化研究に匹敵しました。 他のトレーサーについては、文献に記載されている最適化データが限られています。

このプラットフォームは、放射化学の分野にハイスループット実験のパワーと効率を便利にもたらします。 これは、(i) 既存または新規の放射性医薬品の放射合成プロトコルの迅速な改良と最適化、(ii) 既知の大規模プロトコルの液滴形式への変換、および (iii) 新規の標識法の研究に使用できる可能性があります。 ハイスループットプラットフォームにより、利用可能なパラメータ空間内でより多くの反応条件を探索することが可能になり、時間、コスト、低スループットの理由で従来の方法では試行できなかった好ましい反応条件の発見につながる可能性があります。 各反応に必要な前駆体の量が少ないということは、特に出発物質が少量しか入手できない新規放射性医薬品開発の初期段階では、非常に重要な利点です。 ハイスループットのプラットフォームにより、短期間かつ低コストで合成の開発が可能になります。

Fisher Scientific から購入した無水 N,N-ジメチルホルムアミド (DMF、99.8%)、無水ジメチルスルホキシド (DMSO、≧ 99.9%)、無水アセトニトリル (MeCN、99.8%)、2,3-ジメチル-2-ブタノール (テキシルアルコール、 98%)、4,7,13,16,21,24-ヘキサオキサ-1,10-ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサン (K222、98%)、トリエチルアミン (TEA、99%)、トリフルオロ酢酸 (TFA、> 99%)、テトラヒドロフルラン (THF、> 99.9%、阻害剤不使用)、ヘキサン (95%)、ジクロロメタン (DCM、> 99.8%)、アセトン (99.5%)、ギ酸アンモニウム (NH4HCO2: 97%) N-メチル- 2-ピロリドン (NMP、99.5% 無水)、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン (DMPU、98%)、エチレングリコール (99.8%) および炭酸カリウム ( K2CO3、99.995%) は Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。 n-ブタノール (nBuOH、99%) は、Alfa Aesar (米国マサチューセッツ州ワードヒル) から購入しました。 重炭酸テトラブチルアンモニウム (TBAHCO3、エタノール中 75 mM)、エチル-5-メチル-8-ニトロ-6-オキソ-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[f]イミダゾ[1,5-a][1,4]ジアゼピン-3-カルボキシレート (ニトロマゼニル; [18F]フルマゼニルの前駆体、> 97%) およびフルマゼニル (参照標準、> 99%)、2-((2,5-ジメトキシベンジル)(2-フェノキシフェニル)アミノ)-2-オキソエチル-4-メチルベンゼンスルホネート ([18F]PBR06 前駆体、> 95%)、2-フルオロ-N-(2-メトキシ-5-メトキシベンジル)-N-(2-フェノキシフェニル)アセトアミド ([18F]PBR06 の参照標準、 > 95%)、(S)-2,3-ジメトキシ-5-[3-[[4-メチルフェニル)-スルホニル]オキシ]-プロピル]-N-[[1-(2-プロペニル)-2-ピロリジニル]メチル]ベンズアミド ([18F]Fallypride 前駆体、> 90%)、Fallypride (参照標準、> 95%)、2-(2-((N-4-フェノキシピリジン-3-イル)アセトアミド)メチル)フェノキシ)エチル-4-メチルベンゼンスルホネート ([18F]FEPPA 前駆体、> 90%)、および N-[[2-(2-フルオロエトキシ)フェニル]メチル]-N-(4-フェノキシピリジン-3-イル)アセトアミド ([ 18F]FEPPA、>95%）は、ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg、ドイツ) から購入しました。 脱イオン水は、Milli-Q 浄水システム (EMD Millipore Corporation、ベルリン、ドイツ) から入手しました。 [18O]H2O 中のキャリア無添加の [18F]フッ化物は、UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility および Crump Cyclotron Facility から入手しました。

1% テフロン AF 2400 溶液は Chemours から購入しました。 ポジ型フォトレジスト (MEGAPOSIT SPR 220–7.0) と現像液 (MEGAPOSIT MF-26A) は MicroChem (米国ウェストボロー) から購入しました。 メタノール (MeOH、クリーンルーム LP グレード)、アセトン (クリーンルーム LP グレード)、イソプロパノール (IPA、クリーンルーム LP グレード)、硫酸 (96%、クリーンルーム MB グレード)、過酸化水素 ( 30%、クリーンルーム LP グレード）は、KMG Chemicals (フォートワース、米国) から購入しました。

液滴反応を実行するために、以下の原液を毎日調製しました。 [18F]フッ化物ストック溶液には、60 mM TBAHCO3 と 1.8 MBq/μL (48 μCi/μL) の [18F]フッ化物水溶液が含まれていました (つまり、[18F]フルマゼニル、[18F]PBR06、[18F]Fallypride、および [ 18F]FEPPA)、または 60 mM K222 と 30 mM K2CO3 および 1.8 MBq/μL (48 μCi/μL) の [18F] フッ化物水溶液 (すなわち、[18F]フルマゼニルおよび [18F]PBR06)、または 60 mM ３０ｍＭのＣｓ２ＣＯ３および１．８ＭＢｑ／μＬ（４８μＣｉ／μＬ）の［１８Ｆ］フッ化物を含むＫ２２２の水溶液（すなわち、［１８Ｆ］フルマゼニルの場合）。 [18F]フルマゼニル前駆体ストック溶液には、DMSO、DMF、NMP、DMPU、またはエチレングリコールのいずれかに 70 mM 前駆体が含まれていました。 [18F]PBR06 前駆体ストック溶液には、DMSO またはテキシルアルコールと MeCN の 1:1 v/v 混合物のいずれかに 70 mM 前駆体が含まれていました。 [18F]Fallypride ストック溶液には、テキシルアルコールと MeCN の 1:1 v/v 混合物中に 77 mM の前駆体が含まれていました。 [18F]FEPPA 原液には、テキシルアルコールと MeCN の 1:1 v/v 混合物中に 30 mM の前駆体が含まれていました。 [18F]フルマゼニルの場合、反応溶媒として DMSO または DMF を使用する場合、収集ストック溶液は反応溶媒と水の 2:1 v/v 混合物、または MeOH と H2O 収集ストック溶液の 9:1 v/v 混合物でした。反応溶媒としてNMP、DMPU、エチレングリコールを使用する場合。 [18F]PBR06、[18F]Fallypride、および [18F]FEPPA の場合、収集ストック溶液は MeOH と H2O の 9:1 v/v 混合物でした。

放射能測定は、校正済み線量キャリブレーター (CRC-25R、Capintec、フローハムパーク、ニュージャージー州、米国) を使用して行われました。 各反応部位の開始活性を計算するために、初期の [18F]フッ化物溶液を各スポットにロードした後 (用量キャリブレーターを介して) チップ上の活性を測定し、以前のチップ活性の測定値を差し引きました。 すべての測定値は共通の時点に減衰補正されました。 収集効率は、個々のスポットから収集された粗サンプルの活性を、同じ反応部位で使用された開始活性（減衰を補正した）で割ることによって決定されました。 フッ素化効率はラジオTLCを使用して分析されました。 粗放射化学収率（粗ＲＣＹ）は、収集効率にフッ素化効率を乗算することによって計算された。 チップ上に残った総残留活性は、各反応部位から粗生成物を収集した後、用量キャリブレーターにチップを置くことによって測定した。 個々の反応部位でチップ上に残された残留活性を計算するために、まずチップ上の活性分布がチェレンコフイメージングによって決定されました 33,68,71。 Cerenkov イメージングでは、ガラス製顕微鏡スライド (76.2 mm × 50.8 mm、厚さ 1 mm、C&A Scientific、米国バージニア州マナサス) をチップの上に置き、取得時間は 5 分でした。 RAW 画像は前述のように補正されました 34。 チップ上の特定の反応部位の残留活性は、MATLAB (MathWorks、Natick、MA) で書かれたカスタム関心領域 (ROI) 分析ソフトウェアを利用して計算されました。 各反応部位について ROI が描画され、積分されたチェレンコフ信号が画像から計算されました。 特定の反応部位での残留活性の量を定量化するために、対応する ROI 積分シグナルをすべての ROI の積分シグナルの合計で割り、チップ上の測定された総残留放射能の倍数で割りました。 この値は、特定の反応部位の残存活性をその特定の反応部位で使用された開始活性で割ることにより、開始放射能の割合として表すことができます (減衰を補正)。

64 の同時反応を実行することは、分析にとって大きな課題となります。 一般的に使用される TLC プレートの長さと条件で TLC プレートごとに 1 つのサンプルをスポットする一般的な方法では、サンプルの分離と読み出しごとに 2 ～ 7 分が必要であり、実際には 64 サンプルまで拡張することはできません。 分析を加速するために、TLC プレート (シリカゲル 60 F254; Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) に複数のサンプル (0.5 mm ピッチで 8 サンプル) をスポットし、すべてのサンプルを並行して分離し、我々の方法を使用してチェレンコフ イメージングによって同時に読み出しました。以前に報告しました34。 簡単に説明すると、8 つのサンプル (各 0.5 μL) を 50 mm × 60 mm (幅 × 長さ) TLC プレート上にスポットし、隣接するスポットは 5 mm 離れていました。 展開された TLC プレートは、TLC プレートをシンチレーター プレート (50 mm × 35 mm、厚さ 1 mm、BC-400、サンゴバン、オハイオ州、米国) またはガラス顕微鏡スライド (76.2 mm × 50.8 mm、厚さ 1 mm、A&C Scientific）を使用して、放射された光の画像を取得します。 溶媒フロントが 45 mm (30 mm の分離距離に相当) 移動するのに約 2 分かかりました。 [18F]フルマゼニル粗サンプルを分離するための移動相は 100% MeCN で、[18F]PBR06 粗サンプルの場合は 13:10:24:54 (v/v) ジクロロメタン:クロロホルム:アセトン:ヘキサンを移動相として使用しました。 18F]FEPPA 粗サンプル 25.6:37.5:36.5:0.4 (v/v) nBuOH:THF:ヘキサン:TEA を移動相として使用し、[18F]Fallypride 粗サンプルを 1% TEA を含む 25 mM HN4HCO2 中の 60% MeCN を使用して分離しました。 (v/v)、以前に報告されたとおり33。 Rf 値と TLC 分離研究の詳細については、補足セクションを参照してください。 4.

分析用ラジオ HPLC を使用して、各合成の生成物を同定し (参照標準との共注入により)、純粋な生成物を単離してラジオ TLC で生成物バンドの Rf 値を確認しました。 ラジオ HPLC システムのセットアップは、脱気装置 (モデル 5050)、ポンプ (モデル 1000)、UV 検出器 (254 nm; Eckert & Ziegler、ドイツ、ベルリン) およびガンマ線検出器を備えた Smartline HPLC システム (Knauer、ベルリン、ドイツ) で構成されました。放射線検出器およびカウンター（B-FC-4100 および BFC-1000; Bioscan, Inc.、米国カリフォルニア州ポーウェイ）。 すべての HPLC 分離では、C18 Gemini カラム (Kinetex、250 × 4.6 mm、5 μm、Phenomenex、トーランス、カリフォルニア州、米国) を使用しました。 0.1% TFA (v/v) を含む 3:1 H2O:MeCN の移動相と 1.0 mL/分の流速を使用すると、[18 F]フルマゼニルの保持時間は 11 分でした。 [18F]PBR06 の場合、60:40 (v/v) MeCN:20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH = 5.8) の移動相を使用し、流速 1.5 mL/min で保持時間は 8 分でした。 [18F]Fallypride サンプルは、1% TEA (v/v) を含む 25 mM HN4HCO2 中の 60% MeCN の移動相、流速 1.5 mL/min で分離され、保持時間は 4.5 分となりました。 [18F]FEPPA サンプルは、0.1% H3PO4 を含む 70:30 v/v H2O:EtOH の移動相を用いて 0.8 mL/min で分離され、保持時間は 15.5 分でした。

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著者らは、これらの研究の多くのために[18F]フッ化物を寛大に提供してくれたRoger Slavik、Giuseppe Carlucci、およびUCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facilityのスタッフに感謝している。 また、後の研究のために [18F] フッ化物を生成してくれた Jeffrey Collins にも感謝します。 マイクロ流体基板は UCLA Integrated NanoSystems Cleanroom (ISNC) で製造されました。技術サポートをしていただいたスタッフに感謝します。 この研究は、国立がん研究所 (R21 CA212718 および R33 CA240201)、国立精神衛生研究所 (R44 MH097271)、国立生物医用画像生物工学研究所 (R21 EB024243 および T32 EB002101)、および UCLA によって部分的に支援されました。ユージーン・コタ・ロブレス・フェローシップ（ARへ）。

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アレハンドラ・リオス & R. マイケル・ヴァン・ダム

米国カリフォルニア州ロサンゼルス、UCLA、デイビッド・ゲフィン医学部分子・医学薬理学部門

トラヴィス・S・ホロウェイ & R・マイケル・ヴァン・ダム

米国カリフォルニア州ロサンゼルス、UCLA 生物工学部

フィリップ・H・チャオ＆R・マイケル・ヴァン・ダム

米国カリフォルニア州ロサンゼルス、UCLA 物理天文学部

クリスチャン・デカロ

社会遺伝学研究所、UCLA、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

チェルシー・C・オコロ

クランプ分子イメージング研究所、UCLA、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

アレクサンドラ・リオス、トラヴィス・S・ホロウェイ、フィリップ・H・チャオ、クリスチャン・デ・カロ、チェルシー・C・オコロ、R・マイケル・ヴァン・ダム

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AR は実験を実行し、データを分析しました。 TSH と CO が実験を支援しました。 PHC が高スループット装置を設計し、AR と PHC がシステムを組み立てて特性評価しました。 CD は多重反応シリコンチップを製造しました。 AR と RMV は実験計画に貢献し、原稿を執筆しました。 RMVがプロジェクトを監修しました。 すべての著者が原稿を編集し、最終版を承認しました。

R・マイケル・ヴァン・ダムへの通信。

ヴァン・ダム博士は Sofie, Inc. の創設者であり、連邦補助金の下請けを通じてこのプロジェクトの側面について研究支援を受けています。 残りの著者は利益相反を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Rios、A.、Holloway、TS、Chao、PH 他。 放射化学における経済的なハイスループット実験のためのマイクロリットルスケールの反応アレイ。 Sci Rep 12、10263 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14022-2

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受信日: 2021 年 12 月 9 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 17 日

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